Objectius Observació de: Alliberament dels gàmetes per part dels musclos: Mascles: espermatozoides Femelles: oòcits Les diferents fases del desenvolupament embrionari, des de la fecundació fins a l'estadi larvari Presa de contacte amb les tècniques de la fecundació in vitro. Establir les bases d'un treball experimental, amb material viu.

 

Introducció

La fecundació in vitro és una tècnica d'interès, no només des del punt de vista humà per facilitar la concepció de fills en parelles que presenten problemes d'esterilitat, sinó també en programes de ramaderia o en piscicultura quan el que es pretén es establir la millora de l'espècie.

En aquesta pràctica també és pretén veure el desenvolupament embrionari, és a dir les diferents fases per les quals passa el zigot fins a convertir-se en una larva. Aquestes fases són:

 

 

Material i Equipament

 

Equipament

Reactius i altres materials

Nevera Aparell per escalfar aigua Microscopi, amb possibilitat de fotografies o amb sistema per capturar imatges

Musclos: Mytilus galloprovincialis, com a mínim 6, per assegurar la presència de mascles i femelles. Grandària (> 5cm ) Aigua de mar natural ( preferible) o sintètica Safata de plàstic per posar-hi els musclos Tovallola 10 vasos de precipitats d'aproximadament 250ml. (Es poden substituir per culs d'ampolla de plàstic.) Pipetes Portaobjectes i cubreobjectes En el cas que no es disposi d'un sistema percapturar imatges, cal disposar de: Formol, solució al 10% amb aigua de mar Pots de carretes fotogràfics o similars

 

 

Procediment

 

Muntatge de l'experiència

Cal comprar els musclos el dia anterior a la realització de la pràctica. Un cop a casa o al laboratori, netegeu els epífits que porten les valves i és convenient que peseu i mesureu cada un dels musclos, anoteu les dades. Seguidament disposeu-los en una safata sobre la qual haureu posat la tovallola xopa amb aigua de mar; un cop posats els musclos, podeu assenyalar un ordre concret per poder-los identificar, es tapen amb la mateixa tovallola i es posen a la nevera, fins el dia següent.

 

Execució de l'experiència

a) Estimulació de l'alliberament dels gàmetes. Xoc tèrmic


Poseu cada un dels musclos en un vas de precipitats o bé un cul d'ampolla de plàstic, amb uns 200 ml d'aigua de mar a 4 ⁰C, durant 40'; (aquesta operació es fa individualment per evitar que els gàmetes es barregin).

Simultàniament, escalfeu aigua de mar al bany Maria, fins que s'assoleix una temperatura entre 28-30 ⁰C, i poseu aigua de mar a la nevera.

Passats els 40', decanteu l'aigua freda i la substituï per l'aigua calenta. Feu el canvi musclo per musclo. Els musclos es mantenen en aigua calenta durant 30', durant els quals s'han d'anar controlar, doncs en alguns casos ja hi ha alliberament. En tot cas, si hi ha alliberament de gàmetes, no els farem servir per a la fecundació.

Passats els 30', decanteu l'aigua calenta, i reposeu els 200 ml amb aigua freda, 8-11⁰C. A partir d'aquest moment, s'ha de produir l'alliberament dels gàmetes. Segons la bibliografia els gàmetes òptims per a la fecundació són els que s'alliberen durant les dues primeres hores.

Les femelles alliberen uns agregats de color taronja que es precipiten al fons, mentre que els mascles alliberen un líquid blanquinós que ràpidament es dissolt a l'aigua de mar. (Anotar a cada flascó el sexe de l'individu).

Quan creiem que ja tenim prou gàmetes, retirem el musclo del flascó.

 

b) Observació al microscopi òptic dels gàmetes

• Oòcits: amb una pipeta agafeu mostra del fons i la poseu en un portaobjectes, després de posar-hi el cobreobjectes ja es pot fer l'observació.

• Espermatozoides: amb una pipeta agafeu una mostra d'aigua de mar, i repetiu l'operació feta amb els oòcits.

c) Fecundació

Preparem un vas de precipitats amb 200 ml d'aigua de mar a temperatura ambient. Hi afegim:

• Gàmetes femenins, oòcits, 10ml
• Gàmetes masculins, espermatozoides, 40 ml

NOTA Es poden provar diferents concentracions. El problema és que si no es disposa d'una camera de comptatge mai no se sabrà la concentració real que estem emprant, ja que el nombre de gàmetes alliberat depèn de cada individu. Es pot provar: 1 volum de gàmetes femenins / 5 volums de gàmetes masculins a parts iguals 5 volums de gàmetes femenins /1 volum de gàmetes masculins

Una altra possibilitat és: posar en el flascó 200 ml d'aigua de mar a temperatura ambient. Afegir-hi 2 ml de gàmetes femenins, agafats del pot del flascó on són amb una pipeta. I, posteriorment afegir 48 ml de l'aigua que conté els espermatozoides després d'haver-la homogeneïtzat amb una pipeta.

 

d) Desenvolupament embrionari

A partir d'aquest moment s'han de fer observacions periòdiques al microscopi. Les primeres fases són ràpides, la qual cosa implica que la freqüència d'observació ha de ser alta.

Una temporalització aproximada, utilitzada en la garota de mar és:

Fecundació	Temps 0
Màxim de zigot de dues cèl·lules	+1'30 h
Màxim de zigot de quatre cèl·lules	+2'30 h
Màxim de zigot de vuit cèl·lules	+3'45 h
Màxim de mòrules	+10-12h
Màxim de gàstrules	+24 h
Larves	+48 h

Aquests temps són aproximats, per la qual cosa és aconsellable fer observacions en els intervals intermedis, sobretot entre el màxim de blàstules i la gastrulació.

 

NOTA És important fer un registre dels temps observats, i quines fases s'han trobat a cada una de les observacions. Fóra interessant fer anotar el nombre de cada una de les fases observades. Per fer-ho primer cal decidir un criteri per fer l'observació: per exemple, comencem a mirar per la part superior esquerra del cobreobjectes i anem movent la platina cap a la dreta i cap avall, mirem un mínim de 10 camps i anotem el nombre de vegades que apareix cada una de les fases. També cal anotar les dades d'altres variables com temperatura, hores de llum, salinitat.

 

IMPORTANT Si no es disposa d'un sistema de captació d'imatges, caldrà procedir de manera diferent.

 

A cada temps d'observació, prendrem una quantitat determinada de mostra i la fixarem amb formol.

Un cop les tinguem totes, podrem fer l'observació al microscopi amb més calma.

Procediment:

• Prepareu una solució de formol al 8% amb aigua de mar (Tingueu en comte que el formol comercial és del 37-40%).

• La millor manera de procedir és la següent: Un cop feta la fecundació, és a dir en el temps 0, cal homogeneïtzar la mostra i repartir de forma equitativa els 250 ml entre els diferents rodets que tenim preparats, un volum de 10 ml per rodet és suficient.

• En cada un dels temps que hem predeterminat, afegirem, a un dels rodets, el formol al 8%. El volum afegit, ha de ser igual al volum de mostra que hi he m posat, així la concentració de formol que ens queda és del 4%.
  

És important, afegir el formol poc a poc i deixar-lo regalimar per les parets del tub.

Un cop tenim tots els temps, es pot procedir a l'observació de les mostres al microscopi.

 

En principi aquesta pràctica no suposa cap risc ni té cap component tòxic o nociu per al medi ambient. Només en el cas que s'usi el formol, cal anar en compte amb la seva manipulació. No el pipetegeu amb la boca!!!

 

e) Adquisició i enregistrament de les dades

Com ja hem indicat anteriorment, cal anotar clarament els temps en els quals heu fet les observacions, considerant el moment de la fecundació com a temps 0.

Caldrà fer una taula, on consti el temps d'observació, les fases del desenvolupament embrionari i el nombre observat de cada una de les fases per cada període d'observació.

Per tal de normalitzar les dades i donar un resultat comparable, cal:

Seria aconsellable que, a més de les imatges, féssiu un esquema de les diferents observacions. Des dels gàmetes fins a la larva i totes les fases intermèdies.

 

 

Conclusions

Amb aquesta pràctica s'utilitza un mètode senzill, el xoc tèrmic, per tal d'obtenir gàmetes viables que permetin la fecundació i el desenvolupament embrionari posterior. L'avantatge d'aquest mètode enfront d'altres usats anteriorment, com és el cas de la fecundació de les garotes de mar, recau en el fet que és un mètode que no implica la mort dels organismes. És a dir, si es disposa d'aquaris els musclos s'hi poden tornar i repetir l'experiència en dies posteriors.

Per altra banda, no presenta dificultats de manipulació i en canvi ens permet observar el desenvolupament embrionari pràcticament complert.

Pot ser una experiència purament qualitativa, si sols es fa l'observació de les diferents fases, o pot ser un estudi quantitatiu, si es realitzen els comptatges i s'estableixen les taules dels resultats.

 

Anàlisi de les dades

Tabular les dades obtingudes i realitzeu una gràfica on a l'eix de les x hi hagi el temps a partir de la fecundació (temps 0) i a l'eix de les y hi hagi el percentatge de cada una de les fases.

 

 

Qüestionari

1. Busqueu informació sobre les diferents fases del sistema embrionari i comproveu si concorden amb les vostres observacions.

2. Presenteu un esquema en el qual s'hi representin tots els passos que heu observat des de la fecundació fins a l'aparició de les larves.

4. Per altra banda, i a nivell de laboratori, es duen a terme estudis de contaminació experimental; és a dir, posem els musclos en un aquari en el qual afegim el contaminant que volem estudiar, al cap d'uns dies, es treuen els musclos i s'analitzen per estudiar l'efecte d'aquest contaminant sobre els teixits. Imagineu que també ens interessa veure quin és l'efecte d'un determinat contaminant, ja sigui orgànic o inorgànic, sobre el desenvolupament embrionari. Dissenyeu un possible experiment.